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                組織研磨儀

                簡要描述:補充:如果需要提取的樣品比較多(比如1g),研磨好的樣品在后續的提取中,需要轉移到大的epp管中,研磨時可以加入較少的抽提液,研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補充抽提液,進行后續的操作。

                • 產品型號:GT100
                • 廠商性質:生產廠家
                • 更新時間:2021-09-27
                • 訪  問  量:486
                詳情介紹
                 一、 實驗試劑:

                 

                1.CTAB抽提液:

                2%w/vCTAB

                100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

                20 mmol/L EDTA(pH8.0)

                1.4 mol/L NaCl

                抽提含多酚較多的植物材料時(比如木本植物),上述抽提液中可另加入2%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

                抽提液于室溫保存,可在幾年內保持穩定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%v/v)的β-巰基乙醇。

                2、醋酸鈉:

                3 mol/L NaAc

                用冰乙酸調pH值至4.8-5.2。

                3、TE溶液:

                4、其它:

                無水乙醇,異丙醇,75%乙醇,酚:氯仿:異戊醇(25241),氯仿:異戊醇(241),β-巰基乙醇,重蒸水。

                二、 實驗步驟

                1. 樣品研磨

                1) 1g的樣品放入2ml ep管中

                2) 加入1-25mm研磨珠

                3) 加入1mlCTAB 抽提液

                4) 將加有樣品的ep管放入高通量組織研磨儀的適配器中,蓋好

                5) 將研磨轉速調到1800,設定研磨時間為90秒(可根椐樣品的研磨的難易程度來調節,此數據是以銀杏落葉為樣本得出)

                6) 啟動研磨儀對樣品進行研磨(根據不同的樣品,本身性質不同,需要對研磨頻率和研磨時間進行適當的調整)

                2. DNA的粗提

                1) 將研磨好的樣品取出于65水浴45min,中途間隔(輕柔)振蕩三次混勻

                2) 冷卻后加入等體積氯仿:異戊醇(241),輕柔顛倒混勻使乳化10min

                3) 7000g-8000g離心10min18-20

                4) 吸取上清于另一干凈的離心管中

                5) (根據需要可用氯仿:異戊醇如上法重復抽提一次,吸取上清)

                6) 加入與上清液等體積(且已于-20預冷的異丙醇,顛倒混勻,約12分鐘后應有白色絮狀沉淀出現(若沒有,則加入上清液1/51/10體積的pH4.8-5.23M NaAc,混勻,于-20冰箱中沉淀30min

                7) 離心法沉淀DNA

                8) 75%乙醇中漂洗DNA數分鐘以上,用Tip頭吸干乙醇

                9) 1ml 75%乙醇再漂洗一次

                10) 沉淀于室溫或64以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現半透明,不要過度干燥

                11) 50μlTE溶解沉淀,可用65水浴助溶,DNA粗提物可用于粗略PCR等。

                3. DNA的純化

                1) TE溶解的DNA粗提物中入4-10μl RNaseA(40-100μg)

                2) 37酶解RNA 1hr65酶解RNA 30min以上

                3) 加入50μl酚:氯仿:異戊醇(25241),輕輕顛倒混勻10min

                4) 10000g以上常溫離心10min,吸取上清

                5) 加入50μl仿氯:異戊醇(241)輕輕顛倒10min

                6) 10000g以上常溫離心10min,吸取上清 (根據需要可重復用氯仿:異戊醇如上法再抽提1-2次,以充分去除蛋白和酚)

                7) 向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.23M NaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇,于-20沉淀30min以上

                8) 12000g、4低溫離心10min,吸干液體

                9) 沉淀用75%乙醇漂洗二次

                10) 沉淀于室溫或64以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現半透明狀,勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA,可于65水浴助溶

                11) 5μl DNA電泳檢查DNA的質量

                12) 100-500倍稀釋后于分光光度計上測定OD260OD280,分析DNA的濃度和質量

                13) 保存DNA-20

                補充:如果需要提取的樣品比較多(比如1g),研磨好的樣品在后續的提取中,需要轉移到大的epp管中,研磨時可以加入較少的抽提液,研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補充抽提液,進行后續的操作。

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